崇禎十七年四月，史可法聽說李自成進犯京城，他馬上發動將士準備北上。在浦口渡江的時候，北京淪陷的消息傳了過來。史可法號啕大哭，換上孝服為皇帝發喪。這個時候，南京的大臣都在商量立誰為皇帝，張煌言等人認為按血緣關係排列的話，應該擁立福王朱由崧。但福王是個窩囊廢，隻在吃喝玩樂方麵有天賦，而潞王比較賢明，所以主張立潞王，史可法也同意這個意見。鳳陽總督馬士英卻和閹黨餘孽阮大勾結起來擁立福王，詢問史可法的時候，史可法把不能擁立福王的理由告訴了他們。但馬士英和高傑等人已經把福王送了過來，史可法等人隻好去迎接福王。
福王正式監國後，選舉內閣大臣，大家推舉了史可法、高弘圖和薑曰廣3人。劉孔昭非要爭著入閣，大家以明朝沒有勳臣入閣的先例而製止了。劉孔昭大怒：“就算我不行，那馬士英又為什麽不能入閣？”結果又把奸賊馬士英弄進了內閣。兩天後，史可法被任命為禮部尚書兼東閣大學士，和馬士英等人一起入閣。史可法掌管兵部事宜，馬士英仍然主管鳳陽軍務。
馬士英日夜盼望能當宰相，看到史可法位於自己之上，就把當初史可法寫給他的、列舉了不能立福王的理由的信給了福王，並帶兵入朝，請福王即帝位。史可法不想和小人作對，便請求到淮揚一帶監督軍事。馬士英把江北地區分成4個鎮，由劉澤清、高傑、劉良佐和黃得功4人管轄。這4個人互相之間不服氣，經常爆發衝突。他們都想進駐揚州，高傑捷足先登，其他3個人也都學他的樣子在江淮一帶大肆搶劫。朝廷命令史可法去調解，除了高傑之外，其他3人都聽從命令。高傑是四鎮中最驕橫跋扈的一個，他和黃得功交戰，錯在高傑，史可法負責調停，事情才得以解決。高傑駐守在揚州，非常凶暴，但史可法對他開誠布公，用君臣大義來開導他。高傑逐漸被史可法所感動，接受了他的管束。
史可法作為督師，權力很大，但他從不敢奢侈浪費。他沒有兒子，妻子勸他娶妾，他說：“公事那麽忙，哪裏有空管這事？”除夕夜他還在批閱文件，實在太累了，他就讓廚師給他拿點酒菜來。廚師說肉食都分給將士們過年了，他就拿了點調料來下酒。史可法本來酒量很好，但在軍中他就戒酒了，這天晚上他一口氣喝了幾十杯酒，想起先帝的恩德，不禁黯然淚下，很快就趴在桌子上睡著了。天亮後，將士們都聚集在轅門外，有人告訴了他們不開門的原因。知府任民育說：“督師平時很難得休息，這天晚上他能睡得這麽好，不容易啊。”命令打更的人仍舊打晚上的更，並告誡左右不要吵醒他。
清軍打到宿遷後，史可法派人向朝廷告急，馬士英卻說：“他不過是想給將士們請功罷了。”不久，高傑被許定國殺死，他的部隊全部潰逃。史可法聽到這個消息後流著眼淚說：“不能再在中原有所作為了。”
幾天後，清兵來到城下，將揚州團團圍住。第二天，總兵李棲鳳和監軍副使高岐鳳兩人率部投降，城裏的防守力量更加薄弱了。史可法讓文武官員分別駐守在城牆上，自己親自駐守地勢最為險要的西門。他寫信給家人說：“請將我埋在孝陵附近。”已抱了必死的決心。兩天後，清兵開始攻城。史可法組織軍隊拚死抵抗，殺死大批清兵。清兵很快就發現西北角是明軍的防守重點，於是用大炮猛轟該處，將城牆轟塌。史可法見城已被攻破，想拔劍自刎，但被一個參將救了下來，並將他送到小東門，想讓他逃命。但史可法見清軍大肆殺戮百姓，於是大叫：“我是史督師！”最後被清兵抓住，慘遭殺害。
清兵在攻打揚州的時候死傷慘重，入城後展開了慘絕人寰的大屠殺，一連屠殺了10天之久。當時天氣很熱，10天後史可法的義子史德威入城找他的遺體，城中屍體都腐爛了，根本無法辨認。一年後，他的家人將他的衣服埋在了揚州城外的梅花嶺下，後人在此立祠紀念他。